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分光光度計比濁法測定抗菌物質(zhì)效價

更新時間：2018-11-19 點擊次數(shù)：3435

瓊脂擴散法是測定抗菌物質(zhì)效價常用的方法，但人為操作因素常常影響實驗結(jié)果的準確性。實驗旨在建立一種測定準確、操作簡單、無需特殊設(shè)備的分光光度計比濁法來測定各種抗菌物質(zhì)的效價。研究發(fā)現(xiàn)，以抑菌率高時對應(yīng)的培養(yǎng)時間為取樣時間點，在中等接種量下，在實驗濃度范圍內(nèi)，細菌素 nisin、類細菌素 NFL 和抗生素硫酸慶大霉素這 3 種抗菌物質(zhì)的濃度與抑菌率之間的線性關(guān)系良好，Ｒ2 值均高于 0. 99，標準曲線成立。該法適用于設(shè)備條件簡單的實驗室準確測定各類抗菌物質(zhì)效價。

抗菌物質(zhì)是指具有殺菌或抑菌活性的物質(zhì)，包括細菌素、類細菌素和抗生素等生物活性物質(zhì)。在過去的 60 多年里，多種能準確測定抗菌物質(zhì)活性的方法先后被提出，包括 ATP 生物發(fā)光測定法( ATP Bioluminometry) 、綠色熒光蛋白測定法( GFP bioassay) 、 MTT［3-( 4，5-dimethyl thiazol-2-yl) -2，5-diphenyl tetrazolium bromide］比色法、免疫學方法等［1 － 4］，然而使用這些方法需要特殊的試劑或儀器設(shè)備，因此沒有得到廣泛應(yīng)用。長期以來，瓊脂擴散法( agar diffusion assay) 因無需特殊材料，檢測成本低［5 － 6］而成為測定抗菌物質(zhì)活性常用的方法，但是該法耗時耗力、對操作人員經(jīng)驗要求高、人為影響因素多，實驗者經(jīng)常得不到理想的實驗結(jié)果［7］。1952 年，Berridge 和 Barrett 應(yīng)用微孔比濁法來測定抗生素效價［8］，經(jīng)過幾十年的不斷改進，該法已以成為可以定量測定抗菌物質(zhì)的一種方法［9 － 10］，但是，需要使用酶標儀這一 “短板”限制了其廣泛應(yīng)用，如能建立起分光光度計比濁法無疑將極大提高其應(yīng)用普遍性。為此本研究對于影響分光光度計比濁法準確定量抗菌物質(zhì)效價的關(guān)鍵因素進行了研究，建立了測定細菌素 nisin、類細菌素 NFL［11］和抗生素硫酸慶大霉素等抗菌物質(zhì)效價的分光光度計比濁法。

1 材料與方法

1. 1. 1 菌種金黃桿菌( Chryseobacterium) NHW 菌株、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis) NFL 菌株和乳酸乳球菌( L. lactis) 8148 菌株，為安徽農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室保藏。 1. 1. 2 培養(yǎng)基 STAA 培養(yǎng) 基: 蛋白胨 20 g，酵母抽提物 2 g， K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，甘油 15 g，瓊脂 13 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7. 0 ± 0. 2，121 ℃下 15 min 滅菌后冷卻至 40 ～ 50 ℃ 左右，加入過濾除菌的鏈霉素 500 mg，環(huán)己六亞胺 50 mg 和乙酸鹽 50 mg 混勻，用于培養(yǎng)金黃桿菌 NHW 菌株。 MＲS 培養(yǎng)基: 牛肉浸膏 8. 0 g，Tween-80 1. 0 mL，葡萄糖 20. 0 g，胰蛋白胨 10. 0 g，酵母抽提物 4. 0 g， K2HPO4 2. 0 g，檸檬酸三銨 2. 0 g，醋酸鈉 5. 0 g，MnSO4·H2O 0. 05 g，MgSO4·7H2O 0. 2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6. 0 ± 0. 2。用于培養(yǎng)乳酸乳球菌 NFL 菌株。 GM17 培養(yǎng)基: 補充了 15 g /L 葡萄糖的 M17 培養(yǎng)基( 購自青島海博) ，用于培養(yǎng)乳酸乳球菌 8148 菌株。 1. 2 實驗方法 1. 2. 1 抗菌物質(zhì)抗菌類型的確定乳酸乳球菌 NFL 發(fā)酵上清液的制備: 將活化后的乳酸乳球菌 NFL 菌株以 5% 接種量接種于 MＲS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 培養(yǎng) 12 h，離心( 10 000 r /min，15 min) 取上清液，將上清液過濾除菌，取濾液備用。硫酸慶大霉素、氯霉素和類細菌素 NFL 抗菌類型的確定: 將活化后的指示菌金黃桿菌 NHW 菌株以 5% 接種量接種于 STAA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心( 10 000 r /min，5 min) 取菌體，用生理鹽水洗滌 1 次，將菌體重懸于生理鹽水中，分別添加終質(zhì)量濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液、888. 89 U / mL 的硫酸慶大霉素水溶液、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌上清液，30 ℃下振蕩 ( 150 r /min) 培養(yǎng) 6 h，分別在培養(yǎng)的 0 時刻和 6 h 取 200 μL 發(fā)酵液涂布于 STAA 平板表面，30 ℃下培養(yǎng)測定菌落總數(shù)。 nisin 抗菌類型的確定: 將活化后的指示菌乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 接種量接種于 GM17 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心( 10 000 r /min，5 min) 取菌體，用生理鹽水洗滌 1 次，將菌體重懸于生理鹽水中，添加終濃度為 1. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 0. 02 mol /L) 。30 ℃下靜置培養(yǎng) 6 h，分別在培養(yǎng)的 0 h 和 6 h 取 200 μL 發(fā)酵液涂布于 GM17 平板表面，30 ℃ 下培養(yǎng)測定菌落總數(shù)。 1. 2. 2 不同抗菌物質(zhì)抑菌率曲線的測定將活化后的指示菌以 2% 的接種量接種于相應(yīng) 的培養(yǎng)基中，實驗組分別加入終質(zhì)量濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液 ( 對照為無水乙醇) 、 888. 89 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶液( 對照為無菌水) 、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液( 對照為 MＲS 培養(yǎng)基) 和 0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 對照為 0. 02 mol /L HCl 溶液) ，培養(yǎng)過程中每隔 2 h 取樣，立即轉(zhuǎn)入冰水浴中以終止微生物生長，于 600 nm 波長處測定吸光值( 上海奧析，UV1800紫外可見分光光度計) ，連續(xù)測定至 14 h。對照組加入量與實驗組體積相同，其余方法同實驗組。抑菌率/% = ( OD對照－ OD實驗) /OD對照 × 100 1. 2. 3 抗菌物質(zhì)效價分光光度計比濁法的建立 1. 2. 3. 1 指示菌接種量對取樣時間點的影響乳酸乳球菌 8148 接種量對 nisin 效價測定取樣時間點的影響: 將活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株分別以 2% 、5% 、8% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，分別在 30 ℃下靜置培養(yǎng) 1、2、3 h，取樣，測定抑菌率和發(fā) 酵液濁度增量，濁度增量 OD600 = OD600實驗－ OD600起始。金黃桿菌 NHW 接種量對類細菌素 NFL 效價測定取樣時間點的影響: 將活化后的金黃桿菌 NHW 分別以 1% 、2% 、3% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為 66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，分別在 30 ℃下振蕩培養(yǎng) 3、4、5 h 取樣，測定抑菌率和發(fā)酵液濁度增量 OD600。 1. 2. 3. 2 測定抗菌物質(zhì)效價標準曲線的建立nisin 效價標準曲線的建立: 將活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為 0. 2、0. 5、0. 8、1. 1、1. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃下靜置培養(yǎng) 2 h，取樣測定抑菌率。另一實驗組中加入終濃度為 0. 4、0. 8、1. 2、 1. 6、2. 0、2. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃ 下靜置培養(yǎng) 5 h，取樣測定抑菌率。 2 h 取樣的 nisin 效價標準曲線的驗證性實驗: 將活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為 0. 4、1. 0 U / mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃ 下靜置培養(yǎng) 2 h，取樣測定抑菌率。根據(jù)標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測定誤差率( ＲSD) 。ＲSD/% = 抑菌率( 實際) －抑菌率( 擬合) 抑菌率( 實際) × 100 類細菌素 NFL 效價標準曲線的建立: 將活化后的金黃桿菌 NHW 以 2% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng) 基，實驗組中加入終濃度為 36. 67、43. 33、50. 00、 56. 67、63. 33 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，分別在 30 ℃下振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣測定抑菌率。測定終濃度為 40、60 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液的抑菌率，用所得標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測定誤差率( ＲSD) 。硫酸慶大霉素效價標準曲線的建立: 將活化后的金黃桿菌 NHW 菌株以 2% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng) 基，實驗組中加入終濃度為 444. 44、533. 33、622. 22、 711. 10、799. 99、888. 88 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶液，分別在 30 ℃ 下振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣測定抑菌率。測定終濃度為 577. 77、755. 55 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶液的抑菌率，用所得標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測定誤差率( ＲSD) 。 2 結(jié)果與分析 2. 1 不同抗菌物質(zhì)的抑菌率曲線從圖 1 可以看出，隨著指示菌在硫酸慶大霉素水溶液中處理時間的延長，細胞逐步被殺死，失去生長能力。而指示菌在 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發(fā)酵上清液中處理 6 h，活菌數(shù)下降幅度均很小，nisin 和氯霉素是已知的抑菌劑，表明 NFL 菌株發(fā)酵上清液具抑菌活性而非殺菌活性。在指示菌培養(yǎng)基中分別添加以上各種抗菌劑后，測定其生長曲線，計算得到抑菌率曲線。從圖 2 可見，抑菌類抗菌劑 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發(fā)酵上

2 抗菌物質(zhì)效價分光光度計比濁法的建立 2. 1 接種量對取樣時間點的影響抑菌率計算的依據(jù)是生物量，而接種量的大小會直接影響微生物細胞生物量的高低，因此研究了指示菌接種量對取樣時間點的影響。從圖 3 可以看出，中等( 5% ) 和較高( 8% ) 接種量下測定 nisin 濃度的取樣時間點均為 2 h。低接種量( 2% ) 下，指示菌培養(yǎng) 3 h 的抑菌率高于 2 h 的，導(dǎo)致測定 nisin 濃度的取樣時間點延后。取樣時間點的確定不僅取決于高抑菌率，還要兼顧指示菌生長增量和培養(yǎng)時間，如圖 3 所示，低接種量( 2% ) 下指示菌培養(yǎng) 3h 的對照組 ( 未添加 nisin ) 發(fā)酵液濁度增量 ( OD600 ) 很低，表明此時體系中的活菌量較低，不能很好地表征 nisin 的抑菌效力，且培養(yǎng)時間偏長。因此，以乳酸乳球菌 8148 為指示菌來測定 nisin 濃度指示菌接種量為 5% ，取樣時間點為 2 h。

2. 2 分光光度計比濁法測定抗菌物質(zhì)效價的標準曲線的建立 2. 2. 1 測定 nisin 效價標準曲線的建立以 5% 接種量接種指示菌乳酸乳球菌 8148，在 GM17 培養(yǎng)基中添加不同終濃度的 nisin，培養(yǎng) 2 h，測定抑菌率，以抑菌率對 nisin 濃度值進行線性回歸。由圖 5 可知，在 nisin 終濃度為 0. 2 ～ 1. 4 U /mL，抑菌率為 25% ～ 98% 的范圍內(nèi)，nisin 濃度與抑菌率之間呈良好的線性關(guān)系( Ｒ2 = 0. 9921) ，驗證性實驗( 表 1) 表明，該方法的準確度較高( ＲSD ＜ 5% ) 。在非取樣時間點測得標準曲線回歸方程的Ｒ2 值低于 0. 99，表明此時取樣測定所得數(shù)據(jù)的線性相關(guān)度偏

2. 2. 2 測定類細菌素 NFL 效價標準曲線的建立乳酸乳球菌 NFL 菌株發(fā)酵上清液中含有類細菌素 NFL，與 nisin 不同，NFL 菌株發(fā)酵上清液不是純品，其中還含有未被細胞利用完的營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn) 物，實驗發(fā)現(xiàn)，本比濁法同樣適用于發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性的定量測定。以 2% 接種量接種指示菌金黃桿菌 NHW 菌株，在 STAA 培養(yǎng)基中添加不同體積的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，培養(yǎng) 4 h，測定抑菌率，以抑菌率對 NFL 菌株發(fā)酵上清液添加量進行線性回歸。由圖 6 可知，在 NFL 菌株發(fā)酵上清液添加量為 36 ～ 64 μL /mL，抑菌率為 7% ～ 58% 的范圍內(nèi)，發(fā)酵上清液添加量與抑菌率之間的線性相關(guān)良好( Ｒ2 = 0. 994) ，驗證性實驗( 表 2) 表明該方法的準確度較高( ＲSD ＜ 5% ) 。

2. 2. 3 測定硫酸慶大霉素效價的標準曲線的建立由圖 7 可知，nisin 測定取樣時間點( 2 h) 所對應(yīng)的時刻是實驗組( 培養(yǎng)基中含 0. 5 U /mL 的 nisin) 生長曲線的對數(shù)前期。如前所述，硫酸慶大霉素的抑菌率曲線與 nisin 等抑菌劑的不同，并沒有呈現(xiàn) 明顯的峰值，但在 4 h 時抑菌率會處于一直較高的平臺，此時對應(yīng)的實驗組也基本處于對數(shù)前期。

3 討論采用比濁法測定抗菌物質(zhì)特別是抗生素效價的文獻不少，方法大致都是將抗菌物質(zhì)加入指示菌培養(yǎng) 體系中培養(yǎng)一段時間( 一般為 2 ～ 5h) 測定濁度，抗菌物質(zhì)濃度的對數(shù)與濁度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 ( Ｒ2 ＞ 0. 99) ［12 － 14］。但這些報道中均沒有說明抗菌物質(zhì)與指示菌培養(yǎng)時間( 即取樣測定濁度的時間點) 的確切依據(jù)。李秀蘭等采用分光度度計比濁法測定抗菌肽活性，抗菌肽濃度與活力單位之間線性關(guān)系良好，但是操作較為復(fù)雜，需要將對數(shù)期的指示菌菌體洗滌后重懸于緩沖液中，加入抗菌肽樣品振蕩培養(yǎng) 30 min 后測定濁度，將所測結(jié)果代入經(jīng)驗公式得到活力單位［15］。同樣，作者也沒有說明為何要培養(yǎng) 30 min，這樣對于其他種類抗菌物質(zhì)效價的測定，并不具有直接的借鑒意義。本研究所建立的比濁法是將抑菌率與抗菌物質(zhì) 濃度之間直接建立線性相關(guān)，并且找到了抑菌劑和抗菌劑效價線性定量測定的關(guān)鍵因子，即取樣時間點。以 nisin 和硫酸慶大霉素的效價測定為例( 圖 5 和圖 9) ，如果取樣時間點選擇得不好，所得的標準曲線Ｒ2 值就會小于 0. 99，達不到線性相關(guān)的要求。無論是 nisin 這種抑菌劑還是硫酸慶大霉素這種殺菌劑，取樣時間點對應(yīng)的都是實驗組( 即培養(yǎng)基中加入抗菌物質(zhì)) 生長曲線的對數(shù)前期( 圖 7 和圖 8) ，這種規(guī)律性可能是因為本法采用的抑菌率指標依據(jù)的是對照組活細胞與實驗組中未被抑制或殺死的活細胞生長能力的比較，當取樣時間點為實驗組的對數(shù)前期，實驗組生物量基本可以反映當時的活細胞數(shù); 如果取樣時間點為實驗組的對數(shù)末期，實驗組生物量會包含部分死細胞，就會偏離效價與抑菌率之間的線性相關(guān)了。除此之外，接種量的大小對抑菌率的高低有顯著的影響( 圖 3 和圖 4) ，雖然低接種量下高抑菌率值較高，但取樣時間點會延后，且指示菌生長速度偏低，并不能很好地表現(xiàn)出抑菌物質(zhì)的作用; 高接種量從檢測時間和高抑菌率方面均較差，因此，接種量的優(yōu)化對于提高本方法的應(yīng)用效果十分必要。本研究所建立的分光光度計比濁法不僅可用來準確測定 nisin、類細菌素 NFL 和慶大霉素的效價，而且具有設(shè)備簡單、操作簡單等優(yōu)點。有理由相信，本方法也可以適用于其他抗菌物質(zhì)效價的測定。首先，測定抗菌物質(zhì)抑菌率曲線，以此為依據(jù)，抑菌劑以高抑菌率對應(yīng)的時間點為取樣時間點，殺菌劑可以結(jié) 合實驗組生長曲線和抑菌率曲線，綜合考慮實驗組對數(shù)前期和抑菌率峰值選擇出合適的取樣時間點; 隨后，測定指示菌不同接種量下的抑菌率，確定合適的指示菌接種量; 后，建立抑菌率與抗菌物質(zhì)效價之間的標準曲線。

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